游离脂肪酸（FFA）含量试剂盒（测血清、动物组织、微生物、细胞） 微量法 100 管/96 样 正式测定务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： 游离脂肪酸，也称为非酯化脂肪酸，在与白蛋白结合的血浆中循环。动物血液中的游离脂肪 酸 (FFA )含量是一项重要的生理生化指标。血清中游离脂肪酸的浓度与脂类代谢、糖代谢、 内分泌功能有关，游离脂肪酸的浓度会因为糖尿病、重症肝障碍、甲状腺功能亢进等疾病而 上升。 测定原理： 用有机溶剂萃取 FFA。含有 FFA 的有机液与三乙醇胺铜反应,在有机相中形成脂肪酸铜 (铜 皂) FFA 一 Cu。Cu 离子与显色液反应形成紫红色络合物。反应形成的颜色深浅与 Cu 离子 浓度的关系符合朗伯一比尔定律，因此可利用此反应进行比色。 酶标仪、离心机、可调式移液器、96 孔板、蒸馏水。 试剂的组成和配制： 萃取液：液体 120 mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 15 mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：液体 15 mL×1 瓶，4℃保存； 试剂三：粉剂×1 瓶，室温保存； 试剂四：液体 12 mL×1 瓶，4℃保存； 样本处理： 1.动物组织：按照动物组织质量（g）：萃取液 mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组 织，加入 1mL 萃取液），进行冰浴匀浆。震荡提取 15min，5000 rpm 4℃离心 5min，取有 机相待测。 2.血清：吸取 50 μL 血清样本，加入 1 mL 萃取液，震荡提取 15 min 后，4℃，5000 rpm 离 心 5 min，取有机相待测。 3.微生物、细胞：按照细胞数量（104 个）：萃取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建 议 500 万细胞加入 1 mL 萃取液）加入萃取液，冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 2 ，间隔 3 ，总时间 3min）；震荡提取 15 min，然后 5000 rpm 4℃离心 5min，取有机相 待测。 注意：有机相待测液可能存在于上层，也可能存在于下层，注意观察，体积较多的那一层 即为有机相待测液。 测定步骤： 1、 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 550 nm。 2、 工作液的配制：临用根据用量按照试剂一（V）：试剂二（V）：试剂三（m）=1（mL）： 1（mL）：0.66（g）的比例充分混匀。（注意：现用现配，用多少配多少，在空瓶中配 制，试剂盒中带有 4 个空瓶，先将试剂一与试剂二混合，后再加入试剂三粉剂） 3、测定管：吸取600μL样本，加入200μL工作液，盖紧后震荡20 min，4℃，5000 rpm离 心5 min，分层后取200μL上层有机相，加入100μL试剂四，摇匀，10 min后测定550 nm的 吸光值，记为A测定。 4、空白管：吸取600μL萃取液，加入200μL工作液，盖紧后震荡20 min，4℃，5000 rpm离心5 min，分层后取200μL上层有机相，加入100μL试剂四，摇匀，10 min后测定550 nm的 吸光值，记为A空白。 空白管只需测一次。△A=A测定-A空白 注意：1、有机溶剂易挥发，加入96孔板后应尽快检测。 2、测定管中加入的样本即样本处理中的有机相待测液。 FFA 含量计算： 标准曲线：y = 0.0161x - 0.0141 R2 = 0.9985 x：棕榈酸标准品浓度（nmol/mL） y：吸光值差值△A 1、血清 FFA 含量计算： FFA 含量(μmol/mL)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000 =1.242×(△A+0.0141) 2、动物组织、微生物、细胞中 FFA 含量计算： （1）按样本蛋白浓度计算 FFA 含量(μmol/g 鲜重)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷（W×V1÷V2）÷1000 =0.062×(△A+0.0141)÷W （2）按样本蛋白浓度计算 FFA 含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V1×Cpr)÷1000 =0.062×(△A+0.0141)÷Cpr V1：加入样本体积，0.6mL；V2：萃取液体积，1mL；V3：加入血清（浆）体积，0.05 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：动物组织样品质量，g； 1000：1 μmol=1000 nmol 。 注意事项： 1. 蛋白含量不可直接用萃取液提取的有机相待测液直接测定，可用蒸馏水或缓冲液或生理 盐水选用本公司的 BCA 法蛋白含量测定试剂盒。 2. 低检出限为 20 nmol/mL。 |
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