超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基,可攻击生物大分子,如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等,使其交链或者断裂,引起细胞结构和功能的破坏,与机体衰老和病变有很密切的关系,清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。AP-TEMED系统产生超氧阴离子,与盐酸羟胺反应生成NO2-,NO2-与对氨基苯磺酸和α-萘胺的作用生成红色的偶氮化合物,在530nm处有特征吸收峰,样品对超氧阴离子的清除能力与530nm的吸光值呈负相关。天平、研钵、低温
离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。
操作步骤:
一、样品处理
1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,10000g离心10min,取上清置于冰上待测。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后4℃,10000g离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 培养液或其它液体:直接检测。
4. 粉剂药物可配制成相同浓度,比如1mg/mL。
二、测定操作
空白管 对照管 测定管
试剂一(μL) 10 10 10
试剂二(μL) 40 40
H2O(μL) 65 25
充分混匀,25℃反应1min
样品(μL) 25
试剂三(μL) 50 50 50
充分混匀,37℃反应30min
试剂四(μL) 50 50 50
试剂五(μL) 50 50 50
充分混匀,37℃显色20min,于微量石英比色皿/96 孔板,以空白管调零,在530nm 处测定对照管和测定管的吸光值,分别记为A 对照管和A 测定管。
注意:空白管只需测定一次。
三、计算公式
超氧阴离子清除率I%= (A 对照管-A 测定管)/ A 对照管×100%
注意事项:
1. 试剂一4℃可保存2 个月,配制好的试剂二4℃可保存一周,建议实验前配制,并尽快使用。
2. 样品处理完后立即进行测定,或者低温保存不超过24 小时