免疫组化实验检测

 


免疫组化实验检测

亿迅亿迅生物科技有限公司具有专业生物实验室，10年以上操作经验资深技术人员，能够专业、高效进行免疫组化实验操作。

实验技术简介：免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合原理，通过化学反应使标记抗体显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽蛋白质)，对其进行定位、定性及定量研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

免疫组化（IHC）技术通过计分法或灰度计量法也可以反应抗原表达量，但其特点在于切片制作过程中保持组织、细胞原有结构及形态，因此可以反应目标抗原在组织结构中分布以及亚细胞定位。组织细胞定位往往是生理功能发挥或变化体现，是研究中常常关注因素。

免疫组化主要步骤:
1.洗载玻片: 将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目是为了是载玻片上硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见凹凸不平表面变平整,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片表面，由于Lys带正电，而大多数组织带负电荷，从而产生吸附作用。
2.包埋组织: 先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，*后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
3.切片：将包埋好组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片厚度，一般为5µm,如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织载玻片置于40°C温水中。
4.捞组织：当组织载玻片置于40°C温水中之前，要先将水浴中气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成误差就比较小了，而且捞载玻片时候方向一致，以便观察，再将捞出来载玻片置于架子上，放入37°C温箱中烘干。
5.脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用主要是二甲苯,依据是相似相溶原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.
6.抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min，从而除去内源性过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮目是为了使抗原位点暴露出来。
7.血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围PBS液，马上加上血清，使一些非特异性位点封闭起来，然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍（900µlPBS：100µl血清封闭液）。
8.加一抗：将温箱中载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。

免疫组化实验检测

9.加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围PBS后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。
10.加SABC: 将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围PBS后加上SABC, 然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
11.加显色剂: 将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围PBS后加上显色剂。（显色剂配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）   A：DAB        B：H2O2        C：磷酸缓冲液
12.复染: 将显色后片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min。
13.脱水：将复染后片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，*后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
14.封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
免疫组化相关试剂：*重要是选择好一抗、二抗或者还有三抗，注意抗体特异性、效价和交叉反应。

【应用范围】

1.病理诊断，如恶性肿瘤诊断和分型； 
2. 观察并比较组织内目蛋白分布情况；
3. 观察并分析不同组织间目蛋白表达和分布差异化； 
4. 比较和分析目蛋白在组织内相对表达量；
5. 组织内目蛋白定性研究；
6. 组织形态观察等。

【实验保证】 

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3. 石蜡组织或切片等等

实验具体收费、标本收集、实验试剂定购等事宜，请联系亿迅亿迅生物。

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