人基质金属蛋白酶-2(MMP-2)elisa试剂盒 |
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本试剂盒含量是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知待测物质浓度标准品、未知浓度样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过HRP。再经过温育和洗涤,去除未结合酶结合物,然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色深浅和样品中待测物质浓度呈比例关系 |
人基质金属蛋白酶-2(MMP-2)ELISA试剂盒 |
试剂样本收集和处理方法 |
在收集样本前都必须有一个完整计划,必须清楚要检测成份是否足够稳定。对收集后当天就进行检测样本,及时储存在4℃备用。对于隔天再检测样本,及时分装后冻存在-20℃备用,有条件,-70℃冻存备用。标本应避免反复冻融。 |
液体类标本: 包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。 |
1.血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。 |
2.血浆:应根据标本要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。 |
3.尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参? 照此实行。 |
4.细胞培养上清:检测分泌性成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。 |
5.培养细胞:检测细胞内成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。 |
6.组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃温度。加入一定量PBS(PH7.4),或组织蛋白萃取试剂,用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。 |
7.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融. |
8.不能检测含NaN3样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶(HRP)活性。 |
人基质金属蛋白酶-2(MMP-2)ELISA试剂盒 |
详细操作步骤 |
1. 加样:标准品设定5个浓度点10个孔,每个浓度设定平行孔,加入50微升不同浓度标准品,空白孔设定1个孔加入50微升蒸馏水(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔,在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品*终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。 |
2. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 |
3. 配液:将30(48T20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T20倍)倍稀释后备用。 |
4. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。 |
5. 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。 |
6. 温育:操作同3。 |
7. 洗涤:操作同5。 |
8. 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟. |
9. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。 |
10. 测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。 |
试剂盒操作过程中有什么注意事项 |
1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。 |
2. 浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。 |
3. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。 |
4. 请每次测定同时做标准曲线,做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔孔OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请*后乘以总稀释倍数(×n×5)。 |
5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。 |
6. 底物请避光保存。 |
7. 严格按照说明书操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准. |
8. 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 |
9. 本试剂不同批号组分不得混用。 |
11. 如与英文说明书有异,以英文说明书为准。 |
计算方法 |
操作完成之后,详细计算方式是:以标准物浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品OD值由标准曲线查出相应浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物浓度与OD值计算出标准曲线直线回归方程式,将样品OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品实际浓度。 |
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