NAD,NADH 在 340nm 下有特征吸收峰,监测 340nm 吸光度的减小速率可间接反应 ICL 活性。
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操作步骤:
一、样本的前处理:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(10
4个):
提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波
破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);15000g 4℃离心
10mi n,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL
提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤:
将上述试剂按顺序加入 1 mL 玻璃比色皿中,加试剂六的同时开始计时,在 340nm 波长下记
录 20 秒时的初始吸光度 A1 和 2 分 20 秒时的吸光度 A2,计算ΔA =A1-A2。
注意:若一次性测定样本较多,可将试剂一、二、三、四、五和样本按比例配成混合液,在 37℃
(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min 以上,测定时加入 1220µL 混合液和 300µL 试剂六
测定。
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