发布时间：2017/8/22 14:03:21 阅读人数：2837
1、蛋白质抽提
A、实验对象为组织样品，取适量（250-500mg）新鲜组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白。
B、实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白。
2、蛋白质定量
按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3、变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)
将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进个孔中，电泳分离蛋白。
4、蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜
5、膜的封闭和抗体孵育
A、膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
B、封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
C、加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6、结果检测
化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
7、数据分析
目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。
8、提供实验报告
包括详细的实验方法及Western Blot实验结果。
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原创作者：南京亿迅生物科技有限公司
